绒山羊犬新孢子虫病的血清学调查

自从1984年**次在挪威的狗上认识犬新孢子虫（Neospora caninum）以来，人们又把它描述为一个新属和种，其实N.caninum已经在世界范围内广泛流行，并呈现为一种严重的牛和狗的疾病。同时，新孢子虫病已经在羊，山羊，鹿，犀牛和马上广泛流行，并且在水牛，红狐和灰狐，北美草原小狼，骆驼和猫科动物中已经报道发现了N.caninum血清抗体。关于山羊N.caninum相关的流产和新生羔羊死亡率已经在美国的矮型山羊上进行了报道。为了确保我省绒山羊新品种的推广和绒山羊改良工作的健康进行，促进地区经济的发展，笔者于2005年5月，对海西州乌兰县发生流产后的改良绒山羊进行了犬新孢子虫病的血清学调查，报道如下。

1 材料与方法 

1.1 GST-NcSAG1t 蛋白在以前的研究中进行了克隆、表达和纯化；阴、阳性标准血清，均为日本国家原虫中心玄学南博士惠赠，青海省畜牧科学院所生物技术研究室保存。

1.2 被检血清的采集和处理 (1)22份被检血清均采自青海省海西州乌兰县柯柯镇北柯柯村的改良绒山羊羊群中的2006年发生了流产的生产母山羊。(2)采血时均空腹、颈静脉采集，采集后摆成斜面，置4℃冰箱5 h后，放在室温待血清析出后收集血清，-20℃冷冻保存待检。

1.3 其他试剂和耗材 均购自国内和Sigma公司供应商。

1.4 ELISA

1.4.1 抗原的包被 抗原GST-NcSAG1t和GST，按5 μg/ml剂量加到包被液中（50 mM car

bonatebicarbonate buffer, pH 9.6），混匀后加到96孔平底微量板（Nunc, Denmark）的孔里，每孔50 μl，

并且在4℃条件下培养过夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05% Tween 20的PBS冲洗一次后，残留的粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液进行封阻，每孔100 μl，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗一次，在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50 μl，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了兔抗山羊的IgG抗体（Bethyl Laboratories, USA），稀释后每孔加50 μl，并在37℃条件下培养1 h。

1.4.5 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加100 μl底物，每 ml底物中含有0.3 mg的2,2azinobis(3ethylbenzthia zoline6sulfonic acid)，0.1 mol的柠檬酸，0.2 mol的磷酸缓冲液和0.003% H2O2，每孔加100 μl。〖JP〗

1.4.6 读数 用Wellscan MK 3酶标读数仪 (Labsystems Dragon, Finland) 在光吸收值OD415nm条件下测定光吸收值。

1.4.7 判定标准 ELISA滴度表示成**稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST-NcSAG1t 孔和 GST 孔之间的光密度吸收值是不同的，两个孔之间的差值为该被检样品的光密度吸收值（OD值）。两孔阳性血清对照孔的平均值必须大于 0.1；两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.1；两孔待检样品的平均值等于或大于 0.1 为阳性，低于 0.1 为阴性。

2 结果 

调查表明，所检测的22份被检血清中，共检出N.caninum抗体阳性血清4份，阳性率为18.18%。结果见表1。

4.3 徐雪平等 只对新疆地区的4头牦牛的血清进行了N.caninum检测，结果检出1份阳性，阳性率为25%。我国暂时没有开展有关N.caninum在家畜中流行情况的调查。本研究工作对我们今后开展该领域流行病学调查，打下了一个良好的基础。