副猪嗜血杆菌病病原菌的分离与鉴定

副嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为革拉泽氏病(Glasser’SDisease)，影响从2周龄到4月龄的青年，主要在断奶前后和保育阶段发病。通常见于5～8周龄的，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达到50％。主要临床症状表现为咳嗽，呼吸困难，消瘦，跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为胸膜炎，心包炎，腹膜炎，关节炎和脑膜炎等。随着世界养业的发展，该病已成为全球范围内影响养业的典型细菌性疾病。由于饲养技术的调整以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。近年来，随着水平的**，副嗜血杆菌在我国各场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其损失相当惨重。

为预防该病，国内外虽然研制了**类型的基因工程菌苗与多价灭活菌苗，但由于副嗜血杆菌血清型众多，各个地方的流行菌株各不相同，各个血清型之间的交叉保护性不高，菌苗的免疫效果并不理想。笔者对长治市某大型场的副嗜血杆菌进行了分离和鉴定，以便选择针对性较强的菌株作为菌苗株，以起到更好的预防效果，并为副嗜血杆菌病的进一步研究奠定基础。

1材料与方法

1．1病料的采集对2个病死仔进行尸体解剖(应无菌操作)，打开胸腔和腹腔，首先吸取积液或以棉签拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取内脏，内脏器官须实验室无菌操作，以

灼烧过的手术刀烫烙剖面，取深层组织涂板培养。

1．2主要培养基本试验选择以下配方：胰蛋白胨0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性淀粉0．25g、枸椽酸钠0．15g、普通营养琼脂粉4．5g。加蒸馏水至lOOmL，溶解后调pH至7．2～7．4，然后高压上述混合物，120％，15min。在水浴中冷却至80％。加10mL无

菌脱纤绵羊血，在80％水浴中漩摇10～15min。在冷却至50％时，加入无菌辅酶I(NAD)至15g／mL，加入万古霉素至50g／mL。倾倒大约4mm厚平皿，冷却后4℃保存备用。

1．3病原分离及纯化从分离培养的琼脂平板上挑取灰白或透明、光滑呈露珠样的菌落，巧克力琼脂平板单菌落划线培养。48h后细菌涂片，革兰氏染色镜检。如果为革兰氏阴性

小杆状或多形性小杆菌，再进行一次巧克力琼脂亚克隆培养，同时接种鲜血琼脂平板和普通琼脂平板。巧克力琼脂平板生长良好，而鲜血琼脂平板和普通琼脂平板没有菌落生成则菌株保存待进一步鉴定。经初步筛选的分离株CZ株。

1．4染色镜检挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特点。

1．5生化特性

1．5．1V因子需要试验v因子为辅酶I即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，是细菌呼吸过程中起递氢作用的两种脱氢辅酶。挑取被检分离株和副嗜血杆菌标准株菌落接种兔鲜血琼脂平板和2％胨琼脂平板上，再以金黄色葡萄球菌点种或垂直划线，置37％培养48h。观察葡萄球菌菌落周围菌落生成情况，愈靠近金黄色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈远的愈小，甚至不见菌落生长，该现象即称为“卫星现象”。

1．5．2X因子需要试验x因子是血红蛋白中的血红素及其衍生物，含铁卟啉，121℃高温下30min不被破坏，是细菌合成细胞色素、细胞色素氧化酶、触酶和过氧化物酶等的辅

基。挑取被检分离株和副嗜血杆菌标准株菌落接种2％胨琼脂平板上，再分别贴上浸渍有x、V、X+V因子的圆形滤纸片。如果只有含X+V因子的纸片周围有菌落生长，则表明该

菌株既依赖x因子又依赖V因子。如果只有含V、X+V因子的纸片周围有菌落生长，则表明该菌株只依赖V因子不依赖X因子。

1．5．3生化实验脲酶、葡萄糖发酵、树胶醛糖发酵、乳糖发酵、甘露糖发酵、蜜三糖发酵、过氧化氢酶实验等，采用以下培养基基质或者商品生化反应试剂加入以下特殊培养基成份。配方：BiosatePeptone(BBL)10mg、NaC110mg、酚红0．04mg、高级琼脂15mg、蒸馏水900mL。混合加热溶解，冷后调节pH7．5后分装于密封的瓶子内，121℃15min。这方法可用于大量或微量试验。

2结果

2．1病原的分离及染色镜检CZ株为革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，符合副嗜血杆菌的形态特征。

3讨论

3．1在加抗菌素的选择培养基上接种培养，用特殊的稀释方法可以**副嗜血杆菌的分离成功率5％CO!或蜡罐培养并不能**副嗜血杆菌的生长速度，用脱纤维蛋白的血和胰蛋白胨血液琼脂基质培养成分可以**生长速度；用牛或羊血和胰酶水解酪蛋白琼脂为培养基效果不佳。

3．2疾病发生时期，畜主多采州抗生素治疗，效果往往不理想，其主要原因是副嗜血杆菌的耐药性产生、毒素作用或多种病原混合感染。抗生素的使用给副嗜血杆菌的分离造成极大不便，使我们无法确认采集来的标本中是存在副嗜血杆菌。

3．3金黄色葡萄球菌等产色素的细菌及酵母茵在生长产过程中可合成v因子，并在培养基中扩散，满足v子依赖性细菌的生长需求，所以出现卫星现象。卫星现象的产生可以用

来鉴别剐嗜血杆菌的v因子依赖性。

3．4嗜血杆菌属的多数细菌生长需要供给x子但副嗜血杆菌生长不需要x因子。如果只有含V、X+V因子的纸片用有菌落生长，则表明该菌株只依赖V因子不依赖x因子。本实验中出现v因子依赖性的前提下，x因子依赖阳性的可以否定是副嗜血杆菌。

3．5南于副嗜血杆菌有较高的培养要求，其生化实验的关键是特殊培养基基质的选择，或者商品生化反应管的营养改良。m清、NAD等成份的加入可以**副嗜血杆菌的培养成功，但是必须**加入的成份不改变生化试剂的PH值等生化特性。